一.實驗名稱:細胞的復蘇

二.實驗目的:將凍存的細胞恢復活性

三.實驗原理:在低于-70℃的超低溫條件下,有機體細胞內部的生化反應其緩慢,甚至終止。所謂冷凍保存,就是將體外培養物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某度(一般是低于-70°c的超低溫條件),并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶,對細造成損害。

四.實驗步驟

1.實驗前準備

1).將珠浴器（DHB-200）預熱至37℃,將培養液預熱后分裝到培養皿中

2）.離心管、吸管、培養瓶等等

2.取出凍存管

1）.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號.

2）.從液氫罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號

3.迅速解凍

1）.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動的液體迅速融化

2）.約1-2min后凍存管內液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。

4.平衡離心:用架盤天平平衡后,放入離心機中3000r/min離心3min

五.制備細胞懸液

1）.吸棄上清液

2）.向離心管內加入10m培養液,吹打制成細胞懸液

六.細胞計數:細胞濃度以5x105/ml為宜。

七.培養細胞

將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶養瓶放入37℃5%CO2的培養箱內24小時(或者24-48小時)后換液繼續培養培養,換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1.珠浴器（DHB-200）未預熱或者未預熱到37℃

2.珠浴器（DHB-200）內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長

3.離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。

版本2

一.細胞復蘇的原則

在實際操作中,凍存細胞要進行復蘇,再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化,以避免慢速融化水分滲入細胞內,再次形成胞內結晶損傷細胞

二.細胞復蘇的主要操作步驟

(1)佩戴眼鏡和手套,從液氮罐中取出安瓿或冷凍管

(2)迅速放入38℃恒溫珠浴器（DHB-200）中,并不時搖動,在1分鐘內使其完全融化,然后在無菌下取出細胞

(3)在1000r/min速度下離心5~10分鐘,棄去上層液,加入適量培養液后接種于培養瓶中,接種濃度1×10°幾L,置37℃溫箱靜置培養,次日更換一次培養液,繼續培養,觀察生長情況。若細胞密度較高,及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中,并加入培養基貼壁培養12~24小時后,充去上清,換入新鮮培養基繼續培養。

三.注意事項

在細胞復蘇操作時,應注意融化凍存細胞速度要快,可不時搖動安瓿或冷凍,使之盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高,生長及形態良好。然而,由于凍存的細胞還受其他因素的影響,有時也會有部分細胞死亡。此時,可將不貼壁、飄浮在培養液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉,再補以適量的新培養液,也會獲得較為滿意的結果。